ГОСТ 25583-83 (CT СЭВ 1744-79) (17.03.1988) ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА

С изменениями:

(17 марта 1988 г.)

Agricultural Poultry. Methods of laboratory diagnostics of infectious bronchitis

ОКСТУ 9809

Группа С79

Срок действия установлен с 1 июля 1983 г.

Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавливает методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1744-79.

1.1 Для вирусологического исследования берут пробы тканей и органов - трахеи, слизистой оболочки носовой полости, почек и легких убитой или только что павшей птицы, а от взрослой птицы - почек и яйцеводов.

1.2 Для серологического исследования берут не менее чем от 10 голов птицы дважды с интервалом 14-21 сут пробы крови по 5 см³ от каждой птицы. Отстаивают сыворотку крови.

1.3 Пробы органов и тканей или их 10 %-ную суспензию хранят при температуре минус 20 °С. Пробы сыворотки крови хранят без добавления консервантов при температуре минус 20 °С.

2.1. Вирусологический метод

Сущность метода заключается в изолировании и идентификации возбудителя заболевания на куриных эмбрионах или на культуре клеток.

2.1.1. Аппаратура и материалы

Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37-38 °С;

инкубатор;

ступки фарфоровые;

центрифугу с частотой вращения 3000 мин^-1;

пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см³ по ГОСТ 25336-82;

овоскоп;

шприцы с иглами;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуру клеток почек куриных эмбрионов или фибробласты;

раствор Хенкса;

стрептомицин, пенициллин.

2.1.2. Подготовка к исследованию

Пробы органов и тканей растирают в стерильной ступке в физиологическом растворе в соотношении 1:10 и экстрагируют в течение 2 ч при 4 °С. Суспензию центрифугируют с частотой вращения от 1500 до 2000 мин^-1 в течение 15 мин. В надосадочную жидкость добавляют 2000 ЕД/см³ пенициллина и 2 мг/см³ стремтомицина, выдерживают при комнатной температуре 1 ч и делают высевы на питательные среды.

2.1.3. Проведение исследования

Обработанную антибиотиками надосадочную жидкость инокулируют в дозе 0,2 см³ через воздушную камеру в аллантоисную полость шести куриным эмбрионам 9-суточного возраста.

Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5 °С и относительной влажности 60-70 % и два раза в день овоскопируют. Эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после заражения, не учитывают. Оставшихся в течение 72 ч трех живых эмбрионов убивают охлаждением при температуре 4 °С, а остальных собирают и охлаждают через 7 сут после заражения. От первых трех эмбрионов собирают аллантоисную жидкость и хориоаллантоисную оболочку для следующего пассажа, а остальные эмбрионы исследуют на наличие макроскопических изменений.

Проводят шесть последовательных пассажа, вируса на куриных эмбрионах, так как первый пассаж в большинстве случаев не вызывает гибели или изменения эмбрионов.

Идентификацию вируса проводят на 9-суточных куриных эмбрионах в реакции нейтрализации (РН), используя известные специфические антисыворотки как минимум к двум основным серотипам вируса (Massachusets, Connecticut) с индексом нейтрализации антисывороток более 3 lg (см. п. 2.2.3.1), или в реакции нейтрализации в культуре клеток почек куриных эмбрионов или фибробластов (см. п. 2.2.3.2).

2.1.4. Обработка результатов

2.1.4.1. Вирус считают идентифицированным и результат положительным, если эмбрионы, инокулированные смесью испытываемого вируса со специфической антисывороткой, остаются живыми и развиваются нормально, а эмбрионы, инокулированные только испытываемым вирусом, погибают или отстают в развитии; у эмбрионов наблюдается перекручивание тела, сворачивание тела в шар, уменьшается количество амниотической жидкости, оболочки плотно прилегают к эмбриону.

В культуре клеток при положительной реакции специфическая антисыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный вирусом инфекционного бронхита.

2.1.4.2. Исключен с 1 июля 1988 г. - Изменение N 1

2.2. Серологический метод

Сущность метода заключается в выявлении у переболевшей птицы специфических антител в реакции нейтрализации (РН) и реакции преципитации в агаровом геле (РПАГ).

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют:

баню водяную;

термостат с температурой нагрева 37-38 °С;

центрифугу с частотой вращения 3000 мин^-1;

пробирки вместимостью 10, 15 и 20 см³ по ГОСТ 25336-82;

пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 20292-74;

чашки Петри по ГОСТ 25336-82;

штамп для изготовления лунок в агаре;

воронку по ГОСТ 25336-82;

пенициллин;

стрептомицин;

агар очищенный или агар Дифко;

мединал;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуры клеток почек куриных эмбрионов, выращенные на среде с 10 %-ной телячьей сывороткой;

среды питательные для культуры клеток;

антисыворотки типоспецифические к инфекционному бронхиту, положительные;

штаммы эталонные вирусов инфекционного бронхита разных антигенных типов;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, 0,87 %-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

2.2.2. Подготовка к исследованию

Пробы сыворотки крови инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Загрязненную сыворотку фильтруют через бактериальные фильтры или обрабатывают антибиотиками.

2.2.3. Проведение исследования в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах

2.2.3.1. В реакции используют вирус с титром не ниже 10⁷ ЭИД 50/1 см³. Готовят серийные десятикратные разведения вируса от 10^-3 до 10^-8. Равные количества разведенного вируса, специфических антисывороток и испытываемых сывороток крови смешивают и смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

Каждым разведением инокулируют по четыре куриных эмбриона 9-суточного возраста в аллантоисную полость в дозе 0,2 см³. Инокулированные куриные эмбрионы овоскопируют ежедневно в течение 3-8 сут (в зависимости от используемого штамма); погибшие эмбрионы в течение первых 24 ч не учитывают.

2.2.3.2. Обработка результатов

По истечении 3-8 сут определяют инфекционный статус каждой группы инокулированных куриных эмбрионов и вычисляют ИД₅₀. Разница между логарифмами титра контрольного ряда вируса и титра смеси вируса с испытываемой сывороткой выражает индекс нейтрализации.

При значениях индекса нейтрализации от 0,0 до 1,0 результат реакции считают отрицательным, от 1,1 до 2,0 - сомнительным, от 2,1 и выше - положительным.

Если для 20 и более процентов испытываемых сывороток крови получится сомнительный результат, исследование проводят в реакции преципитации в агаровом геле. При получении сомнительных результатов проводят исследование сывороток крови, полученных при повторном взятии крови от птицы на 14-21 сут. Вируснейтрализующие антитела образуются через 2-3 недели после вспышки заболевания и сохраняются пожизненно, а преципитирующие антитела - от 2 до 7 недель после начала заражения.

2.2.4. Проведение исследования в реакции нейтрализации на культурах клеток

2.2.4.1. Берут свежеполученную культуру клеток при образовании сплошного монослоя и адаптированный к культурам клеток вирус с титром 5-5,5 ед/см³.

Готовят серийные 10-кратные разведения вируса до 10^-6. Каждое разведение вируса смешивают с равным количеством типоспецифической сыворотки. Если в реакции используются кроличьи контрольные сыворотки (положительная и отрицательная), их разводят до 10^-1, так как неразведенные сыворотки вызывают неспецифическое гранулирование цитоплазмы клетки. Разведение сыворотки учитывают при вычислении индекса нейтрализации. Для каждого разведения вируса и смеси вируса с сывороткой берут по четыре пробирки. Разведения вируса и смеси вируса с сывороткой вносят в каждую пробирку в объеме 0,1 см³, адсорбируют в течение 30-40 мин при комнатной температуре, а затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,9 см³, содержащую 2,5 % телячьей сыворотки, и инкубируют при 37,5 °С в течение 6 сут.

2.2.4.2. Обработка результатов

Учет реакции ведут по цитопатическому действию вируса. Разница логарифмов титра вируса и смеси вируса с сывороткой считается индексом нейтрализации. Результат реакции определяют по п. 2.2.3.2.

2.2.5. Проведение исследования в реакции преципитации в агаровом геле

2.2.5.1. Очищенный агар или агар Дифко от 1,1 до 1,5 %, содержащий 8 % хлористого натрия и имеющий рН 7,6-7,8, наливают в чашки Петри. Штампом делают лунки (углубления) диаметром 4 или 6 мм на расстоянии 4 мм друг от друга. На дно каждой лунки наносят каплю расплавленного агара; антиген получают из гомогенезирозанных хориоаллантоисных оболочек (ХАО) погибших куриных эмбрионов, инокулированных адаптированным к ним штаммом. Выбирают только те ХАО, которые показывают четкую и сильно выраженную реакцию с преципитирующей специфической антисывороткой; сыворотки - контрольные (положительная и отрицательная) и испытуемые должны быть в нативном состоянии и не инактивированными. Чашки Петри выдерживают во влажной камере при температуре 37 °С или при комнатной температуре в течение 24-72 ч.

Кроме контрольной положительной и отрицательной сывороток, в РПАГ ставят и контроль на антиген, изготовленный из гомогената ХАО незараженных куриных эмбрионов того же самого возраста.

2.2.5.2. Обработка результатов

Появление линии преципитации между антигеном и сыворотками свидетельствует о положительном результате.

Небольшой процент положительных результатов в реакции преципитации в агаровом геле выявляют в том случае, если заражение птиц происходило за 2-7 недель до исследования.

Если устанавливают большой процент преципитирующих сывороток, стадо птицы считают неблагополучным по инфекционному бронхиту.