ГОСТ 25587-83 (CT СЭВ 1742-79) ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

С изменениями:

(17 марта 1988 г.)

Agricultural poultry. Methods of laboratory diagnostics of Newcastle disease

Группа С79

ОКСТУ 9809

Срок действия установлен с 1 июля 1983 г.

Настоящий стандарт распространяется на кур, индеек, фазанов, цесарок, перепелок, павлинов, голубей и устанавливает методы лабораторной диагностики болезни Ньюкасла.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1742-79.

1.1. Для выделения вируса от больной или павшей птицы берут головной мозг, трахею, легкие, селезенку.

Пробы патологического материала берут с соблюдением правил асептики в стерильную стеклянную посуду без консервирования или с 50 %-ным раствором глицерина на дистиллированной воде.

1.2. Для определения антител в сыворотке крови берут стерильно в пробирки, увлажненные физиологическим раствором, пробы крови из подкрыльцовой вены птиц. Полученную кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 °С в течение 1-2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой и оставляют на 16 ч в рефрижераторе при температуре 2-4 °С.

Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

С целью ретроспективной диагностики пробы крови берут через 12-14 сут после первых признаков клинического проявления болезни.

1.3. Сыворотку исследуют в течение 3 сут с момента взятия. В случае длительного хранения в сыворотку добавляют мертиолат натрия в концентрации 1:10000.

1.4. Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом с сопроводительным документом, содержащим данные о клинике, эпизоотологии заболевания и вскрытии трупов.

1.5. До начала лабораторного исследования патологический материал и сыворотки крови хранят в рефрижераторе при температуре 2-4 °С.

2.1. Метод выделения вируса

Сущность метода заключается в выявлении патогенного действия вируса на эмбрионы кур, его гемагглютинирующих свойств с последующей идентификацией серологическим методом, определении титра и вирулентности выделенного вируса.

2.1.1. Аппаратура, реактивы и материалы

Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37-38 °С;

центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000 мин^-1;

стаканы центрифужные вместимостью 50 и 100 см³;

весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,01 г;

размельчитель тканей;

овоскоп;

колбы конические стеклянные вместимостью 100 см³ по ГОСТ 1770-74;

пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см³ по ГОСТ 25336-82;

пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 20292-74;

ступку фарфоровую;

шприцы с иглами;

стекло кварцевое;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, 0,87 %-ный раствор (физиологический) с рН 7,2-7,4;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, 3 %-ный раствор или другие дезинфицирующие растворы;

натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280-76, трехзамещенный, 5 %-ный раствор на физиологическом растворе;

йод по ГОСТ 4159-79, 5 %-ный раствор;

антибиотики (пенициллин, стрептомицин, неовитин);

парафин по ГОСТ 23683-79;

развивающиеся эмбрионы кур 9-10-суточного возраста;

эритроциты кур в физиологическом растворе, 1 %-ная взвесь; готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше 6 мес из подкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором лимоннокислого натрия. Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500 мин^-1 в течение 10 мин. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 1 %-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 °С.

2.1.2. Подготовка к исследованию

Пробы патологического материала стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:5 с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом, центрифугируют с частотой вращения 1500-2000 мин^-1 в течение 20 мин.

Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и обрабатывают в течение 30 мин при комнатной температуре антибиотиками: 1000-2000 ЕД/см³ пенициллина и 500-1000 ЕД/см³ стрептомицина для подавления бактериальной микрофлоры. Проводят контроль надосадочной жидкости на стерильность с использованием питательных сред мясопептонного бульона (МПБ), мясопептонного агара (МПА), мясопептонного печеночного бульона под вазелиновым маслом (МППБ) и среды Сабуро

2.1.3. Проведение исследования

Надосадочную жидкость исследуют в капельной реакции гемагглютинации с 1 %-ной суспензией эритроцитов кур.

Для исследования одной пробы материала берут 15 эмбрионов 9-10-суточного возраста. 10 эмбрионов заражают, а 5 служат контролем.

Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу пуги. Сбоку эмбриона между кровеносными сосудами отмечают участок для прокола скорлупы и инокуляции испытуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют и обрабатывают фламбированием. В центре воздушного пространства и в месте введения материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 см³ испытуемого материала на глубину 2-3 мм в аллантоисную полость. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 120 ч при температуре 37 °С.

В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют ежедневно утром и вечером. Эмбрионы, погибшие в течение первых 24 ч, уничтожают, остальные сохраняют в холодильнике при температуре 4 °С.

Через 72 ч инкубации пять эмбрионов охлаждают при температуре 4 °С в течение 12-18 ч, остальные пять инкубируют до 120 ч, а затем охлаждают при 4 °С в течение 16-18 ч.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют 5 %-ным раствором йода или фламбируют, вскрывают и собирают экстраэмбриональную (аллантоисно-амниотическую) жидкость в стерильные пробирки от каждого эмбриона отдельно. Велогенные и мезогенные штаммы вируса вызывают гибель эмбрионов кур через 30-60 ч инкубации, лентогенные - через 100 ч и более.

Взятые из каждого эмбриона образцы экстраэмбриональной жидкости проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА), которую ставят на стекле путем смешивания капли экстраэмбриональной жидкости с каплей 1 %-ной взвеси эритроцитов кур.

При отсутствии РГА экстраэмбриональную жидкость, взятую в количестве 1 см³ от каждого зараженного эмбриона (не менее 5), соединяют и повторно заражают развивающиеся куриные эмбрионы 9-10-суточного возраста (не менее 10 эмбрионов).

Выделение вируса проводят в течение 3-5 пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2-3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Пробу испытуемого материала считают отрицательной, если во всех проведенных пассажах не будут обнаружены гемагглютинация эритроцитов и патогенное действие вируса (гибель эмбрионов).

При наличии гемагглютинации эритроцитов или гибели эмбрионов проводят идентификацию выделенного вируса, определяют титр и вирулентность вируса на эмбрионах кур.

2.2. Метод постановки реакции гемагглютинации

Сущность метода заключается в способности вируса болезни Ньюкасла агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1.1 и дополнительно:

микротитратор Такачи;

доски из плексигласа.

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вируссодержащего материала от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок планшетки из плексигласа (или пробирок) наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см³. Затем в первую лунку вносят 0,2 см³ вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 см³ смеси во вторую лунку и т.д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см³ смеси удаляют в дезинфицирующий раствор (1 %-ный раствор гидроокиси натрия).

В каждую лунку добавляют по 0,2 см³ 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Планшеты с лунками встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Контролем реакции служат две лунки (пробирки) с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах, по 0,2 см³ каждого. РГА также можно ставить микротитратором Такачи в объеме 0,025 см³ в планшетах с лунками.

2.2.3. Обработка результатов

Образование на дне и стенках лунок (пробирок) осадка эритроцитов в виде опрокинутого "зонтика" свидетельствует о положительной РГА.

При отрицательной реакции в опыте и контроле эритроциты образуют на дне лунок (пробирок) диск с ровными краями.

Титром вируса считается предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует 1 агглютинирующей единице (1АЕ).

2.3. Метод идентификации вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующую способность вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с эталонными специфическими сыворотками к вирусу болезни Ньюкасла и типировании антител в сыворотке крови больных, переболевших или подозреваемых в заболевании птиц с эталонными диагностическими антигенами вируса болезни Ньюкасла. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса гриппа птиц.

2.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.2.1, и дополнительно:

аппарат Киппа;

баню водяную;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, 30 %-ный раствор;

мел;

набор диагностический специальный, который содержит по одной ампуле (флакону) сухого эталонного антигена вируса болезни Ньюкасла и гриппа птиц (по 1 см³ антигена в каждой фасовке) и по одной ампуле (флакону) специфической иммунной сыворотки к вирусу болезни Ньюкасла и вирусу гриппа птиц (по 1 см³ сыворотки в каждой фасовке);

сыворотки иммунные; готовят следующим образом: содержимое ампулы (флакона) со специфической сывороткой разводят 1 см³ физиологического раствора. Антиген готовят следующим образом: ампулы (флаконы) с антигенами разводят физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) до первоначального объема высушенного вируса, т.е. добавляют 1 см³ физиологического раствора.

2.3.2. Подготовка к исследованию

Для получения рабочей дозы вируса (4АЕ) образец экстраэмбриональной жидкости или антигена разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления на 4 цифры, указывающей гемагглютинирующий титр вируса.

Например, если титр гемагглютинации 1:256, то рабочее разведение будет 256:4 = 64. Для его приготовления необходимо взять 63 см³ физиологического раствора и 1 см³ исходного вируса. Разведенный 1:64 вирус будет содержать 4АЕ.

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4АЕ. Для этого берут пять лунок; в первую и вторую наливают по 0,2 см³ вируссодержащего 4АЕ, после чего во вторую третью, четвертую и пятую лунки наливают по 0,2 см³ физиологического раствора. После пипетирования из второй лунки переносят 0,2 см³ смеси в третью и т.д., из пятой лунки удаляют 0,2 см³ в дезинфицирующий раствор. Таким образом, во второй лунке остается 2АЕ, в третьей - 1АЕ, в четвертой - 0,5АЕ, а в пятой - 0,25АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см³ 1 %-ной суспензии эритроцитов, доски встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Контролем реакции служат две лунки (пробирки) с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах по 0,2 см³ каждого.

При правильном выборе рабочей дозы (4АЕ) в первой, второй и третьей лунках должна быть полная агглютинация, а в четвертой и пятой лунках агглютинации не должно быть.

Если в четвертой лунке оказывается частичная или полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. Особенно важно, чтобы в третьей лунке, где должна быть 1АЕ вируса, была полная агглютинация. Если в ней агглютинация не полная, то выбранная рабочая доза содержит меньше 4АЕ и должна быть увеличена.

Для приведения рабочей дозы к 4АЕ добавляют соответственно физиологический раствор или вирус и повторно проверяют величину рабочей дозы вируса.

2.3.3. Проведение исследования

Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см³ физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см³ приготовленной специфической сыворотки. Во второй лунке пипетируют и переносят 0,2 см³ смеси в третью лунку и т.д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 см³ рабочего разведения вируса (4АЕ). Доски встряхивают и после 30 мин контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см³ 1 %-ной суспензии эритроцитов.

Для точности учета РТГА ставят контроль:

сыворотки - для исключения присутствия гемагглютининов к куриным эритроцитам (0,2 см³ сыворотки, 0,2 см³ физиологического раствора и 0,2 см³ 1 %-ной суспензии эритроцитов);

стандартных диагностикумов (0,2 см³ 2АЕ антигена, 0,2 см³ гомологичной ему сыворотки и 0,2 см³ 1 %-ной суспензии эритроцитов);

эритроцитов - на спонтанную агглютинацию (0,2 см³ физиологического раствора и 0,2 см³ 1 %-ной суспензии эритроцитов).

Учет результатов проводят визуально через 20-30 мин после оседания эритроцитов в контроле.

2.3.4. Обработка результатов

РТГА считают положительной, если специфическая сыворотка к вирусу болезни Ньюкасла полностью тормозит гемагглютинирующую активность вируса (испытуемого штамма) не менее 1/4 до 1/8 ее гомологического титра.

2.4. Метод титрования вируса

Сущность метода заключается в определении титра вируса на эмбрионах кур.

2.4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно:

развивающиеся эмбрионы кур 9-10-суточного возраста от птицы, вакцинированной вакциной из группы лентогенных штаммов не менее чем за 3 мес до сбора инкубационного яйца.

2.4.2. Подготовка к исследованию

Готовят 10-кратные разведения испытуемого вируса следующим образом:

в 10 стерильных пробирок наливают по 9 см³ стерильного физиологического раствора. Затем в первую пробирку вносят 1 см³ испытуемого вируса, не касаясь ее содержимого, получают разведение 10-1. Затем новой пипеткой после 3-кратного перемешивания содержимого в первой пробирке отбирают 1 см³ и переносят во вторую пробирку, не касаясь ее содержимого. Так готовят и последующие разведения до 10^-10 включительно, используя при этом на каждое разведение отдельную градуированную пипетку.

2.4.3. Проведение исследования

Приготовленными 10-кратными разведениями вируса инокулируют по четыре куриных эмбрионов по п. 2.1.3 в дозе 0,1 см³ и инкубируют в течение 120 ч. Овоскопию проводят каждые 12 ч, при этом эмбрионы, погибшие в первые 24 ч, не учитываются.

Через 120 ч инкубации все эмбрионы охлаждают при 4 °С в течение 16-18 ч и с экстраэмбриональной жидкостью зараженных эмбрионов ставят РГА.

Из погибших и выживших эмбрионов принимают в расчет только те, которые дали положительную РГА.

2.4.4. Обработка результатов

Вычисление ЛД₅₀ для куриных эмбрионов проводят по методу Рида и Менча.

2.5. Метод определения вирулентности вируса

Сущность метода заключается в определении вирулентности вируса для куриных эмбрионов.

2.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.4.1.

2.5.2. Подготовка к исследованию

Подготовка к исследованию - по п. 2.4.2.

2.5.3. Проведение исследования

Типизация вируса проводится определением среднего времени гибели 9-10-суточных куриных эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой.

Для проведения исследования используют разведения 10^-1, 10^-7, 10^-8, 10^-9 и 10^-10.

Каждым из этих разведений инокулируют по пять эмбрионов 9-10-суточного возраста в аллантоисную полость в двух повторностях с разрывом в заражении 12 ч, т.е. заражают в 8 ч утра по пять эмбрионов каждый указанным разведением и в 20 ч этими же разведениями вновь по пять эмбрионов. Зараженные эмбрионы овоскопируют ежедневно через 8 ч: в 8 ч утра и 16 ч, регистрируя время гибели каждого эмбриона в течение 12 ч.

2.5.4. Обработка результатов

Минимальной летальной дозой (МЛД) считают самое большое разведение, вызывающее гибель всех инокулированных эмбрионов. Среднее время гибели (СВГ) вычисляют делением суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванных минимальной летальной дозой, на число эмбрионов. У велогенных штаммов СВГ составляет до 60 ч, у мезогенных штаммов - от 60 до 90 ч, у лентогенных штаммов - более 100 ч.

2.6. Метод определения специфических антител

Сущность метода заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующее действие вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

2.6.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.3.1, и дополнительно:

глицерин по ГОСТ 6259-75;

лед сухой;

калий йоднокислый.

2.6.2. Подготовка к исследованию

Исследуемые сыворотки для удаления термолабильных ингибиторов прогревают в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.

Абзац исключен с 1 июля 1988 г. - Изменение N 1

Допускается обрабатывать сыворотки раствором йоднокислого калия. Для обработки сыворотки 0,2 см³ сыворотки смешивают с 0,6 см³ раствора А (0,256 г KIO₄ в 100 см³ бидистиллированной воды) и инкубируют в водяной бане в течение 15 мин при 18-20 °С. После этого добавляют 0,6 см³ раствора Б (1 см³ глицерина в 100 см³ физиологического раствора), а также 0,2 см³ физиологического раствора. Полученную смесь несколько раз встряхивают и используют в качестве основного разведения сыворотки 1:8 для исследования.

2.6.3. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения сыворотки на физиологическом растворе от 1:2 до 1:1024. РТГА проводят по п. 2.3.3.

Абзац исключен с 1 июля 1988 г. - Изменение N 1

Учет реакции проводят через 30 мин после оседания эритроцитов в контроле.

2.6.4. Обработка результатов

Титром сыворотки считают последнее ее разведение, которое дает полную задержку гемагглютинации с заведомо известным антигеном.

Абзац исключен с 1 июля 1988 г. - Изменение N 1

Выделенный и типизированный со специфическими сыворотками вирус служит основанием для постановки диагноза с учетом клинических, патологоанатомических и эпизоотологических данных.

2.7. Постановка биопробы

Постановку биопробы проводят только в сомнительных случаях (отсутствие клинических признаков и патологоанатомических изменений у птиц при выделении вируса из гомогенатов исследуемых органов).

Биопробу проводят на неиммунной к болезни Ньюкасла птице того же возраста (старше 90 сут) и породы, на которой установлено заболевание.

Перед постановкой биопробы птиц проверяют на отсутствие в крови антигемагглютининов.

Четырем птицам (у которых не обнаружено в крови антигемагглютининов) внутримышечно вводят 1,0 см³ 10 %-ной суспензии исследуемых органов или аллантоисной вируссодержащей жидкости. За зараженной птицей устанавливают наблюдение в течение 10 сут.

При наличии в исследуемом материале вирулентного вируса болезни Ньюкасла птица заболевает через 3-5 сут после заражения и погибает через 2-5 сут после начала заболевания.

При отрицательном результате биопробы зараженные птицы должны остаться живыми. При гибели хотя бы одной из четырех зараженных птиц биопроба считается положительной.